4. Diagnostik, Prognosemarker und -scores – Adulte Weichgewebesarkome

Hintergrund

Bei Verdacht auf einen malignen Weichgewebetumor ist die kontrastmittelverstärkte Magnetresonanztomographie (MRT) als primäre Bildgebungsmethode zu favorisieren, da hiermit die beste Darstellung der Tumorgrenzen und eine Differenzierung fetthaltiger Tumoren aber auch zystischer sowie nekrotischer und nicht nekrotischer Tumoranteile gelingt.

Weichgewebetumoren sind oft heterogen aufgebaut, wobei der aggressivste Tumoranteil zumeist am niedrigsten differenziert ist (also das höchste Grading aufweist) und daher das biologische Verhalten des Tumors bestimmt. Häufig sind dies Regionen mit der höchsten Tumorzelldichte, der stärksten Vaskularisation und daher der höchsten Glukoseaufnahme. Die Bildgebung vor Biopsie sollte primär mittels MRT mit i.v. Kontrastmittel und Diffusionswichtung durchgeführt werden, um die Tumorgrenzen bestmöglich einschätzen zu können. Bei Kontraindikationen gegenüber einer i.v. kontrastangehobenen MRT sollte alternativ eine i.v. (und ggf. enteral) kontrastangehobene CT oder PET-CT mit i.v. Kontrastmittel durchgeführt werden.

Die wichtigste Schnittebene zur Bestimmung der Tumorgrenze ist in der MRT die axiale Schnittrichtung. Das Untersuchungsprotokoll der MRT sollte mindestens eine T1w Sequenz (SE oder TSE) in einer Langachse (coronar oder sagittal), zwei T2w Sequenzen in axialer Schichtrichtung und einer Langachse und zwei T1w Sequenzen nach i.v. Kontrastmittel in axialer Schichtrichtung und einer Langachse beinhalten. Dabei sollte eine T1w Sequenz ohne Fettsättigung vor und nach Kontrastmittelgabe mit identischen Aufnahmeparametern gemessen werden, um die „echte“ Kontrastmittelaufnahme erkennen zu können. Die Ortsauflösung sollte in Schichtrichtung etwa 0,5 x 0,5 mm betragen, die Schichtdicke 3 bis 5 mm. Eine axiale T2-Sequenz ohne Fettsättigung ist obligat Teil des Untersuchungsprotokolls. Eine DIXON-Sequenz ist bei entsprechender Ortsauflösung als Alternative akzeptabel. 

Ergänzend zu den oben genannten Sequenzen sollte eine diffusionsgewichtete Sequenz durchgeführt werden. Dies ist hilfreich zur Bestimmung der Dignität, der höchsten Zelldichte vor einer Biopsie und zur Abgrenzung von einem Hämatom.

Zur Detektion von Kalkanteilen im Tumor, einer knöchernen Beteiligung des Tumors oder zur Abschätzung einer Frakturgefährdung sollte ein konventionelles Röntgenbild oder eine CT in Nativtechnik durchgeführt werden. Der Kalkanteil eines Weichgewebetumors kann mittels MR-Diagnostik unterschätzt oder nicht erkennbar sein.

Bei retroperitonealen Tumoren kann die CT mit i.v. KM der MRT bezüglich des lokalen Stagings ebenbürtig sein und kann hier alternativ eingesetzt werden. Die CT scheint relativ gut zwischen gut- und gering differenzierten Sarkomen unterscheiden zu können [81]. Für die Abgrenzung von Sarkomen zu neurovaskulären Bündeln und bei der Frage nach einer Infiltration der Knochen bietet sich hingegen eher die MRT an [82], [83], [84].

Hintergrund

Das frühzeitige Staging bei malignitätsverdächtigen Weichgewebetumoren kann in einigen Fällen die interdisziplinäre Diagnosefindung und Dignitätsbeurteilung erleichtern, wenn eine bereits metastasierte Erkrankung festgestellt wird. Dies erlaubt eine zeitnahe weitere Therapieplanung und die Einleitung weiterer diagnostischer, insbesondere auch molekularpathologischer Untersuchungsmethoden (z. B. Mutationsanalyse bei metastasiertem gastrointestinalem Stromatumor).

Hintergrund

Aufgrund der steigenden Anforderungen an die Zahl und Qualität der an einer Biopsie durchzuführenden diagnostischen Methoden wird vom regulären Einsatz einer Feinnadelbiopsie zur Sicherung der Erstdiagnose abgeraten, da hier quantitative und qualitative Einschränkungen bestehen. Auch wird durch diese Maßnahme das Einholen einer referenzpathologischen Zweitmeinung durch das limitierte Material erschwert. Eine verlässliche Graduierung von Sarkomen ist an einer Feinnadelbiopsie zumeist nicht möglich, insbesondere bei hoch differenzierten Läsionen oder spindelzelligen Sarkomen mit geringer Proliferationsaktivität [88]. Bei der Diagnose von high-grade Sarkomen ist diese Technik besser geeignet, erreicht aber auch nur eine „accuracy“ von 91 % [89]. Bei geplanter neoadjuvanter Therapie wird von einer ausschließlich feinnadelbioptischen Diagnosesicherung generell abgeraten. Durch den Einsatz kaliberstärkerer Stanzbiopsienadeln, idealerweise in „Full Core“ Technik, kann deutlich mehr diagnostisches Material gewonnen werden, das dann auch für immunhistochemische und molekularpathologische Untersuchungen zur Verfügung steht.

Auch wenn die Feinnadelaspirationsbiopsie erhebliche Limitationen in der definitiven histologischen Zuordnung haben kann, ist sie mit hoher Sensitivität und Spezifität in der Lage, maligne von benignen Läsionen zu trennen [90]. Eine Feinnadelaspirationsbiopsie kann somit zur histologischen Sicherung eines Lokalrezidivs oder von Metastasen bereits zuvor histologisch gesicherter Weichgewebesarkome erwogen werden.

Hintergrund

Der Zugangsweg sollte in einer interdisziplinären Besprechung vor der Biopsie festgelegt werden.

Die Stanzbiopsie ist heutzutage ein vielfach in Leitlinien empfohlenes Verfahren zur Probengewinnung bei Weichgewebetumoren. In Studien konnte gezeigt werden, dass diese Technik hinsichtlich der diagnostischen Genauigkeit in erfahrenen Händen der offenen Biopsie vergleichbar [91] oder allenfalls geringgradig unterlegen ist [92]. Perkutane Biopsien benötigen einen kleineren Zugangsweg als offene Biopsien, was die Resektion des Punktionstraktes im Rahmen der späteren definitiven Operation erleichtert [93], [94], [95]. Die Stanzbiopsie erfolgt, auch wenn mehrere Gewebeasservierungen vorgenommen werden, typischerweise über einen Zugang. Dies ist bedeutsam, da sowohl bei der offenen Biopsie als auch bei der perkutanen Biopsie Tumorzellabsiedlungen im Punktionstrakt gefunden werden können. Es konnte gezeigt werden, dass nach offener Biopsie signifikant häufiger Zellabsiedlungen im Biopsietrakt vorliegen als nach perkutaner Biopsie [96]. Die Summe dieser Faktoren haben dazu geführt, dass die Stanzbiopsie in Kombination mit optimaler Bildgebung als geeignet angesehen werden kann, das weitere therapeutische Vorgehen zu steuern [97], [98]. Ein systematischer Review mit Metaanalyse belegte, dass die Stanzbiopsie eine hohe diagnostische Genauigkeit hinsichtlich der Dignität eines Weichgewebetumors aber auch hinsichtlich der Subtypisierung eines Weichgewebesarkoms hat. Auch aufgrund der geringeren Komplikationsrate kann die Stanzbiopsie als Methode der ersten Wahl angesehen werden [99].

Für eine adäquate histologische Diagnostik sind besondere Anforderungen an die Biopsie zu stellen. In der Regel stellen kleinere Läsionen eine Herausforderung an die Biopsie dar; sowohl was die technische Erreichbarkeit der Läsion als auch was die Gewinnung der Probe angeht. Für Weichgewebesarkome konnte die technische Machbarkeit auch bei kleinen Läsionen gezeigt werden, jedoch bestehen auch hier Einschränkungen. Die Stanzbiopsie ist bei Läsionen ab etwa 1 cm Durchmesser einsetzbar, jedoch sinkt bei Läsionen < 2 cm die diagnostische Genauigkeit dieses Verfahrens [100]. Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor auf die histologische Untersuchbarkeit ist die Länge und insbesondere die Anzahl der Proben. Es konnte gezeigt werden, dass bei einer Anzahl ab 4 Proben bei Weichgewebetumoren ein Plateau in der diagnostischen Genauigkeit erreicht wird [101]. Entsprechend existierender Empfehlungen sollten Nadeln von zumindest 16G Durchmesser eingesetzt werden [85].

Hintergrund

Die Inzisionsbiopsie erbringt üblicherweise die größte diagnostisch verwertbare Gewebemenge und damit die höchste diagnostische Sicherheit. Die Schnittführung soll so gewählt werden, dass keine gesunden Strukturen, besonders Nerven und Gefäße, kontaminiert werden. Der Zugang muss bei der später erfolgenden Tumorresektion komplett mit entfernt werden. Die Inzision sollte möglichst longitudinal erfolgen. Eine Drainage durch die Inzision oder ausgeleitet direkt in Verlängerung der Inzision soll zusammen mit einem Verband eine Hämatombildung vermeiden.

Eine Exzisionsbiopsie als erste diagnostische Maßnahme kann bei oberflächlichen, scharf begrenzten Läsionen unter 3 cm Durchmesser erwogen werden, sofern eine sichere Entfernung des Tumors im Gesunden gewährleistet ist [86]. Britische Chirurgen analysierten die Daten von 3018 Patienten mit primären benignen (52 %) und malignen Weichgewebtumoren in einer hierarchischen Analyse, die Trennschwelle zwischen benigne/maligne in der Größenregion zwischen 3 und 5cm zu finden. Eine Analyse nach dem Bayesain Modell zeigte die praktisch relevante Tumorgröße an, ab der mit einer hohen Wahscheinlichkeit von einem Malignom ausgagnegen werden konnte [102]. Konsequenterweise wurde an alle britischen Chirurgen ein Golfball versendet mit dem Begeleittext „If your lump is bigger than a golf ball and growing, think Sarcoma“.

Hintergrund

Schnellschnittuntersuchungen sind bei Weichgewebetumoren weder zur Dignitätsbeurteilung noch zur Subtypisierung oder Graduierung geeignet und werden daher nicht empfohlen. In Einzelfällen kann die Schnellschnittuntersuchung bei der Beurteilung knapper Resektionsränder am Tumorresektat helfen. Dies gilt explizit nicht für differenzierte lipomatöse Tumoren.

Hintergrund

Stanzbiopsate sollten nach Möglichkeit vor der weiteren pathologischen Aufarbeitung mindestens 6 Stunden in ausreichend 4%igem gepufferten Formalin fixiert werden. Eine native Übersendung kann nicht empfohlen werden, da gerade Stanzmaterial sehr schnell austrocknet. Von einer Versendung in NaCl wird dringend abgeraten, da sich dies sehr ungünstig auf die Morphologie auswirkt. Der Ersatz von Formalin durch Alkohol ist ebenfalls nicht angezeigt, da das Gewebe hierdurch unnötig aushärtet und die weitere Prozessierung erheblich erschwert wird. Von Spezialfixantien wie z. B. Bouin’scher Lösung wird dringend abgeraten, da dies eine DNA-Extraktion für eventuell nötige molekularpathologische Zusatzuntersuchungen behindert. Die Elektronenmikroskopie spielt in der Sarkomdiagnostik nur noch eine sehr untergeordnete Rolle, sodass eine Asservierung von Tumorgewebe in entsprechendem Spezialfixans im Allgemeinen nicht vorgesehen ist. Eine Spezialasservierung von Tumorgewebe für eine spätere RNA-Extraktion (z.B. RNA-later) erfolgt zumeist nur in Studien.

Hintergrund

Das in der Pathologie eingegangene Präparat sollte - falls nativ übersandt - unverzüglich oder - falls fixiert - zeitnah von einem qualifizierten Pathologen in Augenschein genommen und fotografisch dokumentiert werden. Vor der Entnahme von Nativproben soll die Probe vermessen und gewogen werden. Die Entnahmestelle von Nativproben soll entsprechend markiert werden, um die spätere Beurteilung der Resektionsränder nicht zu gefährden. Bei größeren Proben sollen diese vor der weiteren detaillierten Aufarbeitung mehrfach eingeschnitten werden, um ein adäquates Eindringen des Formalins in das Gewebe zu gewährleisten. Nach ausreichender Fixierung (zumeist über Nacht) ist eine makroskopische Aufarbeitung nach den Empfehlungen der EORTC [103] vorzunehmen.

Hierzu gehört nach entsprechender Farbmarkierung der verschiedenen Resektionsränder die Auflamellierung in etwa 1 cm breite Scheiben und die Fotodokumentation dieser Lamellen. Auf den entsprechenden Fotos kann eingezeichnet werden, wo Proben entnommen wurden. Als Faustregel gilt die Entnahme von einem Paraffinblock pro cm Tumordurchmesser plus die gesonderte Entnahme von Tumorproben mit Beziehung zu den Resektionsrändern. Das Ausmaß von Nekrosen und Infarktzonen sollte makroskopisch beschrieben und näherungsweise in % quantifiziert werden. Besonderes Augenmerk gilt den Mindestabständen zu relevanten Resektionsrändern und kritischen anatomischen sowie klinischerseits gesondert gekennzeichneten Strukturen. Die tumornahen Resektionsränder werden angefärbt, um eine Beurteilung der Tumorinfiltration zu erleichtern. Als R0 Resektion gilt: keine Tumormanifestation am gefärbten Resektionsrand („no tumor on ink“) [104], [105]. Sofern eine neoadjuvante Therapie vorausgegangen ist, sollte die Aufarbeitung entsprechend der Vorschläge der EORTC-STBSG [103] erfolgen.

Hintergrund

Die Klassifikation von Weichgewebesarkomen basiert auf der Erkennung spezifischer Wuchsmuster (z.B. spindelzellig, klein-blau-rundzellig, biphasisch), dem Gefäßmuster sowie ggf. dem inflammatorischen Begleitinfiltrat und auf dem Nachweis einer linienspezifischen Differenzierung (z.B. lipomatös, muskulär, neuronal, etc.), oder dem Nachweis eines spezifischen Genotyps, sodass immunhistochemische und ggf. molekulare Untersuchungen bei der Diagnostik von Weichgewebesarkomen eine Schlüsselstellung einnehmen [106]. Außerdem müssen Sarkome von anderen Tumoren mit ähnlicher Morphologie wie z.B. sarkomatoiden Karzinomen, malignen Melanomen, Mesotheliomen, Keimzelltumoren oder auch hämatologischen Neoplasien abgegrenzt werden. Viele der verwendeten Antikörper (z.B. CD34, S100) sind nicht entitätsspezifisch und müssen je nach Kontext unterschiedlich interpretiert und für die Diagnose gewichtet werden. Aus diesen Gründen sind häufig bei der Primärdiagnostik umfangreiche immunhistochemische Analysen (sog. Antikörper-Panels) notwendig, die heute bevorzugt in automatisierten Systemen eingesetzt werden.

Für die Basisdiagnostik von Weichgewebetumoren haben sich u.a. folgende Antikörper bewährt: Breitspektrumkeratine, EMA, Ki67, S100, CD45/PanLeu, CD21, CD23, SOX10, MelanA, HMB45, ER/PR, CD10, smooth muscle Actin, Desmin, Caldesmon oder Calponin, Myogenin, WT1, Calretinin, BAP1, Podoplanin/D2-40, CD34, ERG, CD117, DOG1, NSE, Synaptophysin, Chromogranin, CD56, CD99.

Für eine erweiterte immunhistochemische Diagnostik existieren eine Reihe relativ spezifischer Marker, die teilweise auch zum Screening auf zugrundeliegende genetische Veränderungen verwendet werden können. Zu dieser sich ständig erweiternden Gruppe zählen u.a. beta-Catenin (z.B. Desmoid-Fibromatose), MDM2/CDK4 (hochdifferenziertes/de-differenziertes Liposarkom), BRAF V600E (malignes Melanom), TLE1 (Synovialsarkom), STAT6 (solitärer fibröser Tumor, SFT) [104], MUC4 (low grade fibromyxoides Sarkom, sklerosierendes epitheloides Fibrosarkom) [107], TFE3 (alveoläres Weichgewebesarkom), SDHB (SDH-mutierte gastrointestinale Stromatumoren, GIST), HHV8 (Kaposi-Sarkom), c-MYC (strahleninduzierte Sarkome, insbesondere Angiosarkome), CAMTA1 (epitheloide Hämangioendotheliome), FOSB (pseudomyogenes Hämangioendotheliom, epitheloides Hämangiom), INI-1 (maligner Rhabdoidtumor, epitheloides Sarkom, epitheloider maligner Nervenscheidentumor), H3K27me (maligner peripherer Nervenscheidentumor) [108], Brachyury (Chordom), ALK (inflammatorischer myofibroblastärer Tumor), NKX2.2 (Ewing Sarkom), WT1/ETV4 (CIC-rearrangierte kleinzellige Sarkome), BCOR (BCOR-rearrangierte kleinzellige Sarkome) [107], [109]. Sofern eine neoadjuvante Therapie vorausgegangen ist, sollte die Aufarbeitung entsprechend der Vorschläge der EORTC-STBSG [103] erfolgen.

Hintergrund

Die Tumorgraduierung hat bei einigen Tumorentitäten (u.a. Angiosarkome, dedifferenzierte und myxoid-rundzellige Liposarkome, Rhabdomyosarkome, Ewing-Sarkome, alveoläre Weichgewebesarkome, epitheloide Sarkome, Klarzell-Sarkome) eine geringere prognostische Aussagekraft als der histopathologische Subtyp und sollte bei Tumoren der intermediären Dignitätsgruppe (z.B. Dermatofibrosarcoma protuberans, solitärer fibröser Tumor, inflammatorischer myofibroblastärer Tumor u.a.) nicht angewendet werden [110], [111], [112]. Bei den Dignitätsgruppen „intermediär – lokal aggressiv“ und „intermediär – selten metastasierend“ sollten diese Begriffe in der Beurteilung stattdessen im Hinblick auf ihre biologische Bedeutung erläutert werden. Falls ein Grading aus guten Gründen also nicht erfolgt, sollte dies im Befund erwähnt werden, um etwaige Nachfragen zu vermeiden. Auch auf eine TNM-Klassifikation wird bei den intermediären Dignitätsgruppen im Allgemeinen verzichtet (Ausnahme gastrointestinale Stromatumoren).

Bei manchen Tumorentitäten existieren stattdessen alternative Einteilungen zur Risikobewertung, wie z. B. die AFIP-Klassifikation nach Miettinen et al. 2006 [115] oder die Nomogramme von Joensuu et al. [116] (siehe Abbildung 3) bei gastrointestinalen Stromatumoren (s. Kapitel 10.1). Für PECome wurden Prognosefaktoren von Folpe et al. und von Doyle et al. vorgeschlagen, die unter anderem Parameter wie Mitosezahl, Nekrosen, infiltratives Tumorwachstum und Tumorgröße beinhalten [117], [118].

Es wird darauf hingewiesen, dass ein angegebenes Grading an stanzbioptischem Material ggf. nicht repräsentativ ist und zu niedrig ausfällt, da Nekrosen und höhergradige Tumorareale ggf. nicht erfasst sind. Dies gilt insbesondere bei Entitäten mit häufiger Heterogenität wie z.B. lipomatösen Tumoren und Myxofibrosarkomen. Es sind zumeist nicht genügend Gesichtsfelder für eine repräsentative Auszählung der Mitosen vorhanden. Das Ausmaß der Nekrosen kann nicht adäquat abgeschätzt werden. Die in diesem Kontext sicherlich hilfreiche Bildgebung liegt dem Pathologen zumeist nicht vor (auch wenn dies dringend angestrebt werden sollte). Inwieweit zukünftig die Berücksichtigung der Ergebnisse der radiologischen Bildgebung das Grading beeinflussen und verbessern kann, ist bislang nicht an größeren prospektiven Fallserien untersucht worden.

Hintergrund

Die Zahl der identifizierten molekularpathologischen Aberrationen nimmt in Weichgewebetumoren stetig zu [119], [120], [121], [122], [123]. Dabei handelt es sich um chromosomale Translokationen, Amplifikationen oder spezifische Mutationen. Durch die Technologie des Next-Generation Sequencing (NGS) konnten für zahlreiche Entitäten in den letzten Jahren rekurrierende Genfusionen oder andere genetische Alterationen identifiziert werden. Der Nachweis einer rekurrenten genetischen Veränderung kann diagnostisch genutzt werden, und hat teilweise auch eine prädiktive Bedeutung [122], [123], [124]. Bei den Tumoren mit reziproker chromosomaler Translokation bzw. Genfusion liegt in der überwiegenden Mehrzahl der Entitäten nur eine spezifische Genfusion vor, die für diese Entität charakteristisch ist. Selten können die gleichen Genfusionen auch in verschiedenen Tumorentitäten nachweisbar sein, häufiger ist die Beteiligung eines Gens (z. B. EWSR1) an unterschiedlichen Genfusionen in verschiedenen Entitäten. Eine Übersicht über Genfusionen findet sich in der Mitelman Datenbank (https://mitelmandatabase.isb-cgc.org/) [125] und in der COSMIC Datenbank (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/fusion) [126]. Die häufigsten Translokationstypen und genetischen Aberrationen bei Weichgewebetumoren sind in Tabelle „Ausgewählte diagnostisch relevante rekurrente Genfusionen und Treiberveränderungen“ aufgeführt [119]. Für jede genetische Aberration sind verschiedene Nachweis-Möglichkeiten angegeben (z.B. Immunhistochemie, RT-PCR, FISH, NGS).

Bei den nicht pleomorphen Sarkomen gibt es gehäuft Translokationen deren Nachweis therapeutische Konsequenzen haben kann (z.B. NTRK). NTRK-Genfusionen kommen bei manchen Tumorsubtypen z.B. beim Inflammatorischen myofibroblastären Tumor (IMT) in max. 1 % vor. Nach dieser sehr gut therapeutisch zu nutzenden Alteration sollte zielgerichtet nach definierten Algorithmen gesucht werden [127], [128].

Wenn der diagnostische Nachweis für NTRK-Fusionen gesichert ist, stehen für Patienten im metastasierten/nicht operablem Stadium mit Larotrectinib und Entrectinib zugelassene Substanzen zur Verfügung.

Bei den nicht pleomorphen Sarkomen gibt es gehäuft Translokationen deren Nachweis therapeutische Konsequenzen haben kann (NTRK). NTRK-Genfusionen kommen bei manchen Tumorsubtypen z.B. beim Inflammatorischen myofibroblastären Tumor (IMT) in max. 1 % vor.

Hintergrund

Es gibt verschiedene Methoden, um spezifische Genfusionen und Treiberveränderungen nachzuweisen, die unterschiedliche Sensitivität und Spezifität aufweisen [129], [130].

Hybridisierungs-basierter Nachweis (Fluoreszenz in-Situ Hybridisierung, FISH):

Bei der FISH erfolgt der Nachweis einer Translokation oder Genamplifikation durch Verwendung Gen-spezifischer Sonden auf DNA-Ebene. Je nach verwendeter Sondenkombination können ein oder beide an einer Translokation beteiligten Gene durch Split-Signale (z.B. EWSR1 break-apart Sonde) oder Fusionssignale (z.B. COL1A1-PDGFB Fusions Sonde) nachgewiesen werden. Eine fokale Amplifikation eines Genlokus (z.B. MDM2) wird durch Verwendung einer Genlokus-spezifischen Sonde in Kombination mit einer Centromer-Kontroll-Sonde nachgewiesen.

Vorteile der FISH-Untersuchung sind die einfache Durchführung, geringe Kosten, hohe Sensitivität und Spezifität für das entsprechende Bruchereignis und eine kurze Zeit bis zum Ergebnis (ca. 2 Arbeitstage). Nachteilig ist, dass in der Regel nur ein Translokationspartner untersucht wird (z.B. EWSR1), was durch die Beteiligung dieses Translokationspartners an unterschiedlichen, Entitäten-spezifischen Translokationen zu Fehlinterpretationen führen kann, sowie die mangelnde Breite des Verfahrens. Unbekannte oder nicht erwartete Translokationen werden nicht angezeigt. Auch falsch-positive Ergebnisse, bedingt durch koexistente genetische Defekte (wie z.B. falsch-positiver EWSR1-FISH bei INI1–Deletionen, etc.), können auftreten.

Sequenzierungs-basierter Nachweis (RT-PCR, NGS):

Bei den Sequenzierungs-basierten Nachweisen von Translokationsereignissen kann der Nachweis grundsätzlich auf DNA- oder RNA-Ebene erfolgen, wobei aufgrund der teilweise sehr großen intronischen Sequenzen, in denen die Translokationsereignisse auftreten, in der Regel der RNA-basierte Nachweis verwendet wird, da hier die Untersuchung exonischer Bereiche ausreicht. Die Anreicherung der zu untersuchenden Genfusionsabschnitte kann entweder PCR-basiert (RT-PCR, Amplifikations-basiertes NGS Verfahren) oder über Sequenz-spezifische Anreicherung (Hybrid-Capture basiertes NGS Verfahren) erfolgen. Bei den erstgenannten können nur bereits bekannte Genfusionen nachgewiesen werden, da beide Translokationspartner und die genauen Bruchpunkte bekannt und durch entsprechende Primer abgedeckt sein müssen. Bei dem letztgenannten Verfahren können über die Verwendung von genspezifischen Anreicherungsverfahren prinzipiell auch bisher unbekannte Genfusionen nachgewiesen werden, wenn zumindest eines der beiden beteiligten Gene in dem Anreicherungsansatz entsprechend abgedeckt ist.

Vorteil der RT-PCR ist die hohe Spezifität und Sensitivität für das jeweilige Fusionsereignis und die niedrigen Kosten. Der große Nachteil liegt darin, dass zum einen bei bisher unbekanntem und nicht abgedecktem Partnergen die Untersuchung negativ ausfällt, und dass zum anderen wie bei der FISH-Untersuchung nur bekannte und erwartete Fusionen getestet werden können. Der erstgenannte Nachteil trifft auch für Amplifikations-basierte NGS Verfahren zu. Vorteil der Hybrid-Capture basierten NGS-Methodik ist, dass auch bisher unbekannte Genfusionen nachgewiesen werden können, wenn zumindest eines der Partnergene im Assay enthalten ist, sowie die Möglichkeit – bei entsprechender Panelgröße - auch bisher in der Differenzialdiagnose nicht vermutete Fusionsereignisse/Entitäten nachweisen zu können. Nachteil der NGS-Verfahren sind die höheren Kosten, die längere Bearbeitungszeit und die teilweise sehr aufwändige Validierung.